Внутриклеточный транспорт и гликозилирование гидроксипролина

Том 13 научных докладов, номер статьи: 13506 (2023) Цитировать эту статью

355 доступов

1 Альтметрика

Подробности о метриках

Было показано, что экспрессия рекомбинантных белков в растительных клетках с помощью «дизайнерского» гидроксипролинового (Hyp)-O-гликозилированного пептида (HypGP), такого как тандемные повторы мотива «Ser-Pro», повышает выход секретируемого белка. Однако резкая секреция и Hyp-O-гликозилирование белков, меченных HypGP, могут быть достигнуты только тогда, когда растительные клетки выращиваются в среде SH с дефицитом азота. В среде MS были обнаружены только следовые количества секретируемого слитого белка. Это исследование направлено на более глубокое понимание возможного механизма, лежащего в основе этих результатов, путем изучения внутриклеточного транспорта и Hyp-O-гликозилирования усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP), слитого с меткой (SP)32, состоящей из 32 повторов « Мотив Ser-Pro» в клетках табака BY-2. Когда клетки выращивались в среде MS, (SP)32-EGFP образовывал агрегат, подобный тельцу белка, и сохранялся в ЭР, не подвергаясь Hyp-O-гликозилированию. Напротив, слитый белок становится полностью Hyp-O-гликозилированным и затем секретируется в среду SH. Транскриптомный анализ клеток BY-2, выращенных в среде SH по сравнению со средой MS, выявил более 16 000 DEG, при этом многие повышенные уровни DEG связаны с движением на основе микротрубочек, перемещением субклеточного компонента и связыванием микротрубочек. Эти DEG, предположительно, ответственны за усиленный транспорт ER-Golgi меченных HypGP белков, обеспечивая их гликозилирование и секрецию в среде SH.

Растительные клетки стали мощной платформой для биопроизводства рекомбинантных фармацевтических белков, поскольку они предлагают преимущества в безопасности и экономической эффективности по сравнению с другими эукариотическими организмами1,2,3. Подобно клеткам млекопитающих, растительные клетки культивируются в стерильной и контролируемой среде, и цГМФ может быть легко внедрен в производственный процесс. За последние два десятилетия был достигнут существенный прогресс в совершенствовании системы культивирования растительных клеток, что привело к нескольким случаям коммерческого успеха. Примечательно, что одобренный FDA орфанный препарат Elelyso® представляет собой терапевтический фермент, вырабатываемый растительными клетками (глюкоцереброзидазу) для лечения болезни Гоше, который стал первым в мире белковым фармацевтическим препаратом, полученным из растительных клеток, применяемым у людей4,5. Несмотря на этот прорыв, ряд технических проблем ограничивают широкое коммерческое применение этой платформы. Наиболее серьезной проблемой является низкая продуктивность: выход белка варьируется от 1,0 мкг/л до 10 мг/л6,7,8. Более того, интересующий белок имеет тенденцию накапливаться внутриклеточно, что приводит к увеличению затрат на очистку белка.

Эти технические проблемы недавно были решены с помощью запатентованной технологии, получившей название HypGP Engineering, которая включает в себя экспрессию рекомбинантного белка, слитого с меткой гидроксипролин (Hyp)-O-гликозилированного пептида (HypGP), которая может быть в форме тандемных повторов либо Мотив «Сер-Про» или мотив «Ала-Про», обозначенный (SP)n и (AP)n (n = 5, 10, 20, 32). Тег HypGP может действовать как молекулярный носитель, способствуя эффективному транспорту соединенных белков в культуральную среду. В результате эта технология значительно увеличила выходы секретируемых нескольких рекомбинантных белков в культурах растительных клеток9,10,11,12,13 и микроводорослях14. Однако было обнаружено, что на секрецию и Hyp-O-гликозилирование HypGP-меченных белков в растительных клетках сильно влияет состав культуральной среды15. Примечательно, что полностью гликозилированные белки, меченные HypGP, секретировались в больших количествах, когда клетки BY-2 выращивались в среде Шенка и Хильдебрандта (SH) с дефицитом азота, что приводило к низкому накоплению клеточной биомассы. Напротив, небольшое количество секретируемого белка было обнаружено, когда клетки BY-2 выращивались в богатой азотом среде Мурасиге и Скуга (MS)16, которая поддерживала быстрый рост клеток и высокое накопление биомассы. В любом случае внутриклеточные белки, меченные HypGP, оставались негликозилированными9,15,17,18. Интересно, что когда белки, меченные HypGP, экспрессировались в целых растениях (Nicotiana tabacum и Nicotiana benthamiana), большинство синтезированных белков также оставались негликозилированными17,19.